使用SDR®SensorDish閱讀器測量葉片O 2消耗率

     SDR是否可以測量外部代謝產(chǎn)物對葉片O 2消耗率的影響。具體而言，先前在代謝物對葉片O 2消耗速率的影響（使用Astec Global的Q2）中進(jìn)行了觀察，觀察到10 mM脯氨酸（Pro）在14小時(shí)內(nèi)引起大約兩倍的呼吸速率刺激。該測量的關(guān)鍵方面是持續(xù)時(shí)間（> 14小時(shí)）及其動態(tài)性質(zhì)，因?yàn)槲覀儗λ俾孰S時(shí)間的變化感興趣。我采用了SDR設(shè)置，因此可以測量包含樣品的試管頂部空間中的氧氣。

背景：需要進(jìn)行植物呼吸測量

     呼吸通量和光合速率是常規(guī)適用于植物的代謝通量測量方法，因此兩者都是了解植物生物化學(xué)和理學(xué)的關(guān)鍵工具。當(dāng)前存在幾種可以測量植物呼吸氣體交換速率的技術(shù)，例如用于CO 2的紅外氣體分析儀和用于氧氣的Clark型O 2電極。兩種技術(shù)都具有低通量和持續(xù)時(shí)間短的測量技術(shù)，這阻礙了大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，例如，這些實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將用于植物育種者。澳大利亞研究委員會植物能量生物學(xué)中心（PEB）一直處于開發(fā)和試用用于植物的新呼吸測量技術(shù)的前沿。具體來說，使用O2依賴于熒光的猝滅已被用于多種高通量技術(shù)，例如SDRSensorDish®Reader，Seahorse或Astec Global的Q2。然而，在植物科學(xué)中很少使用這些技術(shù)，特別是海馬使用漂浮的植物組織的應(yīng)用受到限制[1]。盡管我們已經(jīng)嘗試過將標(biāo)準(zhǔn)SDR與先前帶有傳感器斑點(diǎn)的玻璃板結(jié)合使用，但是斑點(diǎn)在井底的位置與涉及液體和頂部空間的測量不兼容。目前，PEB的許多呼吸研究均依賴于第二季度。該機(jī)器基本上使用自己版本的傳感器點(diǎn)，這些傳感器點(diǎn)位于頂部螺旋管的蓋子和自動傳感器臂中。Q2可以很好地與各種植物組織配合使用，并且可以大大提高測量能力，如Scafaro et al。，2017 [2]中所評估。簡單的管和蓋設(shè)置也適用于液體介質(zhì)的測量。這是一個(gè)很大的優(yōu)勢，因?yàn)樗试S將化學(xué)物質(zhì)引入呼吸測定法，從而大大擴(kuò)展了其用途[3]。因此，我想測試SDR是否可以與Q2搭配類似的設(shè)置（帶有管和傳感器點(diǎn)帽），以及它是否具有*的測量性能。

     圖1：SDRSensorDish®閱讀器設(shè)置，用于葉盤呼吸測量。將葉片切開并漂浮在固定在底部架子上的螺帽管內(nèi)的緩沖介質(zhì)上。旋緊瓶蓋。頂部機(jī)架適配器已放置在上面。特別提款權(quán)倒掛。

材料與方法

    實(shí)驗(yàn)設(shè)置簡單，快速（圖1）。當(dāng)總?cè)萘繛?56 µL的塑料螺帽管充滿600 µL緩沖溶液（50 mM HEPES，10 mM MES，200 µM CaCl 2，pH 6.6）在存在或不存在10 mM Pro（或所需的任何其他化學(xué)物質(zhì)）的情況下，留有256 µL的空氣頂空。將7毫米的葉盤打孔并漂浮在溶液上，并蓋上管蓋（n = 10）。所有測定中均應(yīng)包括無葉盤的空白試管，因?yàn)樗鼈儽仨毴コ罅勘尘霸胍舨⑻岣邤?shù)據(jù)質(zhì)量。然后使用兩個(gè)3D打印適配器（PreSens）組裝SDR。一個(gè)SDR大約需要15分鐘的設(shè)置時(shí)間。提供的蓋子和管子是高質(zhì)量的。考慮到適配器的小設(shè)計(jì)，該單元的組裝非常堅(jiān)固。在室溫下黑暗中收集氧氣數(shù)據(jù)。該測定以15秒的間隔進(jìn)行過夜（?17小時(shí)）。數(shù)據(jù)已導(dǎo)出到Excel進(jìn)行分析。

結(jié)果

     圖2顯示了一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的氧氣測量結(jié)果，該實(shí)驗(yàn)比較了用SDR記錄的未經(jīng)處理的葉片與經(jīng)過Pro處理的葉片。這些值用于進(jìn)一步的消耗率計(jì)算。我通過減去無葉盤的空白試管中的平均消耗率來校正O 2消耗率隨時(shí)間的變化。然后將速率計(jì)算為移動1.5小時(shí)窗口（圖3A-B）。O 2消耗率軌跡隨時(shí)間的平滑度是用于計(jì)算移動斜率的時(shí)間窗口的函數(shù)：更大的窗口等于更平滑的軌跡。但是，出于本實(shí)驗(yàn)的目的，空白消減后殘留的噪聲不是一個(gè)因素。根據(jù)Scafaro等人的方法，將O 2百分比轉(zhuǎn)換為摩爾值。2017 [2]。

     圖2：用SDR記錄的未經(jīng)處理（左）和經(jīng)過Pro處理（右）葉盤的氧氣測量值。一個(gè)實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。經(jīng)Pro處理的葉盤的刺激呼吸清晰可見。

    結(jié)果表明，SDR板與管和蓋的設(shè)置相結(jié)合，再現(xiàn)了以前使用Q2獲得的結(jié)果。對照葉片中O 2的消耗率隨時(shí)間逐漸下降（圖3A，C）。在Pro處理過的圓盤中，如預(yù)期的那樣，從開始孵育4小時(shí)開始，O 2消耗率隨時(shí)間增加（圖3B，C，D）。在圖3D中，我們比較了兩種不同的擬南芥基因型。該測定法能夠通過重復(fù)六次檢測先前觀察到的品系間表型差異。

資料品質(zhì)

    關(guān)鍵因素是測量之間的技術(shù)差異。與其他呼吸測量設(shè)備相比，對照治療的重復(fù)痕跡顯示出較低的技術(shù)變異：變異系數(shù)為22.7％（其中包括生物學(xué)變異，因此潛在的技術(shù)變異更低）。較低的CV至關(guān)重要，因?yàn)樗勾_定具有合理重復(fù)次數(shù)的樣品類型之間的差異變得更加容易。在Pro處理過的葉盤中，由于生物變化，對Pro的響應(yīng)在葉盤中不太均勻，因此可以預(yù)料到Pro處理過的葉盤中O 2消耗率的變化會增加。
    15 s的測量頻率足以解決數(shù)據(jù)中隨時(shí)間變化的模式。通過將設(shè)備放置在培養(yǎng)箱中來控制溫度的能力是植物呼吸研究的另一個(gè)優(yōu)勢。

    圖3：暴露于外源性化學(xué)物質(zhì)時(shí)葉盤中O 2消耗率的測定。在有或沒有10mM Pro的條件下孵育擬南芥葉盤，并在約15小時(shí)的黑暗中測量O 2耗竭率。通過減去含有緩沖液但沒有葉盤的四個(gè)試管的平均速率來校正速率。（A，B）對照和Pro處理的WT葉盤的單個(gè)跡線（n = 10）。（C）來自A和B的平均跡線。（D）來自Pro和對照處理的WT和突變株的平均跡線，相對于未處理的WT速率顯示（n = 6）。突變株顯示出部分缺乏Pro的呼吸刺激。